Продолжаем обзор технологий производства ферментных препаратов с применением отходов агропромышленного сектора, подготовленных на основе Обзора рынка ферментных препаратов России в 2007 - 2009 годах. Ранее мы предлагали вашему вниманию описание технологии производства протеазы и технологии производства амилазы и глюкомилазы. В данном обзоре представлена технология производства целлюлазы.
Описание фермента. Основные сферы применения
Целлюлаза представляет собой комплекс из трех основных ферментов, действующих совместно:
- Целлобиогидролаза (1,4-β-D-глюкацеллобиогидролаза, КФ 3.2.1.91);
- Эндоглюканаза (эндо-1,4-β-D-глюканглюкогидролаза, КФ 3.2.14);
- β-глюкозидаза (КФ 3.2.1.21).
Целлюлазы гидролизуют целлюлозу с образованием глюкозы, целлобиозы и олигосахаридов.
Эндоглюконазы действуют первыми на аморфные волокна целлюлозы. Это приводит к образованию небольших волокон со свободными редуцирующими и не редуцирующими концами. Затем эндоглюконаза действуют на свободные концы волокон, в результате чего образуется целлобиоза, которая гидролизуется β-гликозидазой с образованием конечного продукта – глюкозы.
Ферментные препараты, способные разрушать целлюлозу находят широкое применение в самых разных отраслях производства. Мировое производство целлюлаз составляет тысячи тонн. Использование целлюлаз позволяет применять безотходные технологии. Гидролиз целлюлозы дает глюкозу, которую можно использовать для производства пищевых и кормовых белковых препаратов, получать из нее спирт для энергетических целей.
Целлюлолитические ферменты с успехом применяют в самых различных производствах, где сырьем являются растительные материалы или отходы переработки растений. В таблице 8 приведены основные сферы применения целлюлаз.
Основные сферы применения целлюлазы
Источник: Обзор рынка ферментных препаратов России в 2007 - 2009 годах, Abercade
Описание основных технологии производства целлюлазы
Целлюлазы синтезируются исключительно микроорганизмами (бактериями, микроскопическими грибами и актиномицетами). Целлюлолитические микроорганизмы преимущественно разрушают целлюлозу и не используют другие компоненты питательных сред в качестве источников энергии.
В качестве возможных продуцентов целлюлаз рассматриваются многие микроорганизмы. Но выделять в среду ферменты в большом количестве способны только микроскопические грибы. Микроскопические грибы – наиболее вероятные продуценты целлюлаз с использованием агроотходов, так агроотходы по составу наиболее схожи с их природными субстратами. Также отмечается, что культивирование грибных продуцентов является наименее затратным процессом при промышленном производстве целлюлаз.
Наиболее полно изучен продуцент Trichoderma reesei, способный разрушать нативную целлюлозу. Однако этот штамм, не смотря на внеклеточную продукцию фермента, производит не самый эффективный целлюлазный комплекс. В результате 40 летних обширных поисков было найдено около 60 продуцентов целлюлаз. Грибы, такие как Humicola, Aspergillus и Penicillium, бактерии, такие как Cellulomonas, Pseudomonads и актиномицеты – Streptomyces применяются для производства целлюлазы. Penicillium, Aspergillus и Humicola гидролизуют нативную клетчатку.
В коммерческом производстве целлюлаз в настоящий момент наиболее распространенным методом получения является глубинное культивирование. Однако поверхностное культивирование обеспечивает более оптимальные условия для роста аэробных микроскопических грибов.
Твердофазное культивирование, по мнению многих авторов, перспективная технология для производства целлюлаз, так как она менее затратна и использует доступные источники клетчатки. Подсчитано, что при производстве 1 килограмма целлюлазы c помощью Clostridium thermocellum, при глубинном культивировании затрачивается 40,36 долларов США, тогда как при поверхностном – 15,67 долларов США (в ценах 2004 года). Однако существуют ограничения в применении твердофазной ферментации: длительное время культивирования и низкая продуктивность.
При промышленном производстве целлюлаз применяют традиционную схему выделения ферментов: экстракция водой водорастворимой части культуры; стабилизация целлюлаз в растворе некоторыми солями; осаждение целлюлаз или их частичное фракционирование органическими растворителями; высушивание влажных осадков.
Агропромышленные отходы давно применяются в качестве дополнительного источника клетчатки и как субстраты для роста микроорганизмов-продуцентов целлюлаз. Углеводными источниками в промышленном производстве целлюлаз являются: солома, отходы обмолота злаковых культур, пшеничные и рисовые отруби, тростниковая меласса и отходы бумажной промышленности. В отечественной ферментной промышленности для производства целлюлаз применяют в основном пшеничные отруби. Наряду с отрубями в составы сред вводятся солодовые ростки, которые богаты витаминами группы В, фосфором, клетчаткой, легкоусвояемыми редуцирующими веществами и аминокислотами. В состав среды также вводят рисовую, овсяную или ячменную шелуху, свекловичный жом.
В качестве примера приведем технологию получения целлюлазного препарата целловиридин ГЗх (Trichoderma viride 44-11-62/3, ОАО "Биотехнология", 1996) на 63 м3 ферментерах. Рекомендуемая регламентная среда для культивирования, %:
- Свекловичный жом - 2,9;
- Солодовые ростки - 1,4;
- Лактоза - 0,3;
- Белотин - 0,2;
- Сульфат аммония - 0,7;
- Дигидрофосфат калия - 1,0;
- Сульфат магния - 0,05;
- Целлюлоза - 0,9.
Водородный показатель среды 5,5 pH. Культивирование проводят в непрерывном режиме семь суток. Удельная активность фермента в культуральной жидкости до 30 ед/мл. Объем культуральной жидкости 32 м3 при коэффициенте загрузки 0,6. Недостатком данного способа для получения целловиридина в промышленных условиях на ферментерах объемом 63 м3 является то, что в качестве источника углерода в питательной среде применяют свекловичный жом. Он даже после дробления имеет пористую структуру, разбухает в воде и всплывает, что приводит к образованию обильной пены. Это является причиной образования заторов в технологических трубопроводах. Для устранения затора технологическую операцию необходимо прерывать. Кроме этого, подобное обстоятельство отрицательно сказывается на работе технологического оборудования.
Все это ведет к значительным механическим потерям, как питательной среды, так и культуральной жидкости и, следовательно, к низкому выходу конечного продукта. Снижение выхода обуславливается главным образом низкой технологичностью питательной среды, связанной с негомогенностью ее состава из-за использования свекловичного жома в качестве источника углерода.
Способы производства целлюлазы с использованием агросубстратов
Источник: Обзор рынка ферментных препаратов России в 2007 - 2009 годах, Abercade
Использование очищенной целлюлозы, для промышленных процессов получения целлюлаз, лишено многих недостатков, но является затратным. Лактоза, целлобиоза, гентобиоза, являются индукторами биосинтеза целлюлозы, но только применение лактозы экономически целесообразно. Исследователи разных стран пытаются найти агросырье, эффективно заменяющее компоненты питательной среды. Научные центры, занимающиеся данной проблемой, расположены в Индии, Нигерии, Бангладеш и Китае. Получены многообещающие результаты, но многие данные противоречивы. При рассмотрении технологий можно выделить несколько важных аспектов.
1) Сырье для культивирования необходимо подготавливать (измельчать, проводить кислотный или щелочной гидролиз).
2) Выбор метода и условий культивирования влияет на ферментный состав целлюлаз. Например, при глубинном культивировании выход эндоглюконаз выше чем при поверхностном.
3) Выбор штамма-продуцента определяет время культивирование (от 1 до 22 дней), также влияет на необходимость добавлять экзогенные источники углеводов, азота, минеральных солей.
Для характеристики ферментного состава целлюлаз принято измерять три активности: FPA (Filter Paper Activity), CMC (Carboxymethyl cellulаse), целлобиозную или β-глюкозидазную. Хотя многие авторы измеряют суммарную целлюлазную активность, или активность только определенного фермента.
Источник: Abercade